重編程研究最新進展—ptf1a將人成纖維細胞重編程為iNSC

        2018年7月20日,中山大學中山眼科中心眼科學國家重點實驗室、中山大學中山醫學院廣東省腦功能與疾病重點實驗室和第三軍醫大學西南眼科醫院與北京百邁客生物科技有限公司合作的多組學研究文章發表在Nature Communications上,該研究從體細胞重編程出發,探究成纖維細胞轉化為誘導性神經干細胞的分子機制,為神經退行性疾病的治療提供了強有力的策略支持。以下是對該文章的詳細解讀。

摘要

        由體細胞重編程的誘導性神經干細胞(induced neural stem cells,iNSC)在神經疾病的細胞替代療法和體外建模中具有巨大的潛力。已有研究證明將成纖維細胞直接轉化成iNSC的方法依賴于幾個關鍵的神經前體細胞轉錄因子(TF),這就提出了一個問題:這種直接的重編程是否可以由非神經前體細胞調控TF來實現。作者發現,非神經前體細胞調控TFPtf1a可以將小鼠和人的成纖維細胞直接重編程為具有分化出神經元、星形膠質細胞和少突膠質細胞的潛能和自我更新能力的iNSC,并在移植后可以改善阿爾茨海默病小鼠模型的認知功能障礙。Ptf1a的重編程活性通過與Rbpj結合的非Notch信號依賴途徑,來維持NSC特化、自我更新和體內穩態。同時作者的數據確定了這是一種用于研究和治療的更安全的非典型iNSC。

研究背景

        包括阿爾茨海默病(AD)、亨廷頓舞蹈癥和青光眼在內的神經退行性疾病已經成為威脅人類健康的全球性疾病。傳統的治療方法可以減緩疾病的惡化,但總體上是無效的,因為在病變部位丟失的細胞得不到補充。但內源性神經發生效率低,不足以修復損傷或疾病所導致的缺陷。再生醫學目前關注的重點是如何產生大量的神經元、膠質細胞或它們的前體細胞,這些細胞能夠在受累組織中整合并發揮作用,從而為損傷修復提供一個有希望的途徑。目前,人類胚胎干細胞(ESC)或誘導性多能干細胞(iPSC)的臨床應用受到其致瘤風險的影響。相比之下,神經干細胞(NSC)被證明是一種不容易發生腫瘤的安全細胞來源,因此為患者特異性細胞替代療法提供了強有力的策略,并為藥物發現和體外疾病建模提供了有用的工具。

        體細胞重編程是一種獲得患者特異性NSC的有效方法。最近的研究表明,小鼠和人類體細胞可以通過特定的組織特異性轉錄因子(TF)和/或化學物質實現重編程,轉化為誘導性NSC(iNSC)/神經前體細胞。TF誘導iNSC的大多數情況中,重編程是通過單獨的Sox2或Sox2結合其它TF實現的。最近研究證明,一個鋅指結構TF-Zfp521可以直接將人類成纖維細胞重編程為iNSC。因此,由TF誘導的體細胞重編程產生iNSC似乎嚴重依賴于Sox2或Zfp521,而這兩種TF通常在具有增殖能力的神經前體細胞中表達,是體內神經發生的關鍵調控因子。事實上,Sox2已被推測為iNSC直接重編程的主調節因子。這就引出了一個問題:神經前體細胞TF是否是這種直接重編程所必須的,以及非神經前體細胞TF是否能夠實現這種重編程。

        在此之前,作者和其他研究者已經發現了大量的TF,它們在視網膜發育過程中的有絲分裂期前體細胞和/或有絲分裂后細胞中表達,在控制視網膜細胞特化和分化方面起著關鍵作用。作者感興趣的是這些前體細胞TF和非前體細胞TF是否有能力將成纖維細胞轉化成iNSC或功能神經元。Ptf1a(pancreas TF-1α)是一個堿性螺旋-環-螺旋(bHLH)TF,是視網膜、小腦、脊髓和胰腺發育中不可或缺的角色。作者發現,與其它典型的iNSC重編程TF不同,Ptf1a在中樞神經系統(CNS)的有絲分裂后前體細胞中選擇性表達。此外,與作者檢測的其它視網膜TF不同的是,Ptf1a的異位表達可直接將小鼠和人類成纖維細胞轉化為可自我更新的、高效的三能性iNSC。這種重編程需要Ptf1a和Rbpj之間的Notch非依賴性互作,以及隨后的參與NSC穩態的TF基因表達和Notch信號的激活。此外,ptf1a重編程的iNSC移植后可以改善AD小鼠模型的認知功能。

材料與方法

1、RNA-seq

材料:miNSC(第10代小鼠誘導性神經干細胞)、小鼠皮質神經干細胞(SCR029)和小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)。測序平臺:Illumina HiSeq 4000。

2、ATAC-seq

材料:35000個MEF細胞,50,000個miNSC10細胞,50,000個SCR029細胞。測序平臺:Illumina HiSeq X Ten。

3、體內外分化試驗

4、行為學試驗

筑巢試驗,曠場試驗,新物體識別試驗,Y迷宮試驗,morris水迷宮實驗。

 

研究結果

 

1.Ptf1a在CNS非神經前體細胞中的表達

        在E12.5時,Ptf1a的抗體免疫標記表明,在視網膜、脊髓、小腦和后腦中幾乎沒有細胞共同表達Ptf1a和細胞增殖標志物Ki67,表明Ptf1a在CNS分裂前體細胞中幾乎不表達。RNA-seq得到的結果與此一致,E14.5鼠的視網膜中Ptf1a低表達,神經前體細胞標志物TF Sox2和Pax6高表達;與MEF相比,小鼠SCR029 NSC中Ptf1a未表達,而Sox2和Pax6高表達。同樣,E11.5-E18小鼠CNS中Ptf1a顯著低于神經前體細胞標志物TF Pax6、Olig2、Zfp521。這些結果表明,Ptf1a是一種非神經前體細胞TF,不太可能參與體內NSC生成。

2.Ptf1a將MEF重編程為自我更新性iNSC

        作者研究了Ptf1a是否有能力將MEF直接重編程為iNSC,發現當MEF感染了強力霉素(Dox)可誘導的Ptf1a的慢病毒,并在含表皮生長因子(EGF)、堿性纖維母細胞生長因子(bFGF)和Dox的N3培養基中培養后,它們開始發生形態變化,在第6天形成群落,從第9天出現大量神經球(圖1 a,b,d)。對照MEF感染Dox可誘導的GFP的慢病毒,幾乎沒有形成任何正常形狀的神經球(圖1 b,d)。當將多個ptf1a誘導的神經球作為混合物收集、分離和再培養后,它們從第3天開始迅速形成新的次代神經球(圖1c),表明它們具有自我更新能力。

        作者分別選取了初代神經球,以克隆的方式獲得了多個重編程的小鼠iNSC (miNSC)細胞系。將它們分別單獨植入到有Dox的平板孔中,發現NSC形態的細胞逐漸從粘附的神經球生長。在含有或不含Dox的情況下,它們被進一步擴增和傳遞了30代。在約第10代時,所有miNSC細胞系不再生成神經球,開始變得均勻,并形成一個典型的NSC單層。與前期試驗發現的每個克隆形成的miNSC具有自我更新能力一致,作者發現~ 32.6%的miNSC10細胞被EdU 脈沖標記,高于野生型鼠NSC細胞系SCR029(18.9%)(圖1 e,f)。因此,通過Ptf1a重編程MEF得到的miNSC具有增殖能力和自我更新能力。相比之下,被GFP慢病毒感染的MEF并不能產生典型的NSC標記物免疫性的神經球,形成的少數球狀體看起來異常,并且在培養時沒有任何擴增能力。

圖1 ptf1a直接將MEF轉化為神經球

        為了證實Ptf1a確實直接將MEF誘導為miNSC,作者使用針對多個NSC標志物的抗體進行了免疫熒光染色。結果表明外源性Ptf1a在神經球中高表達,進而誘導NSC標志蛋白Sox2、Pax6、Olig2和Nestin的顯著表達(圖2a)。在單層miNSC中,Sox2、Pax6和Nestin的表達量仍然很高(圖2a)。qRT-PCR結果與蛋白表達水平相一致(圖2b)。相比之下,與小鼠ESC相比,miNSC細胞系中多能性基因Oct4、Nanog和Klf4的表達量很少,甚至沒有表達(圖2c)。此外,由于細胞命運的改變,miNSC細胞系中MEF標志基因Snai1、Twist2和Col1a1的表達顯著減少(圖2d)。與miNSC中Nestin基因的轉錄活性一致,其啟動子在miNSC和對照SCR029細胞中低甲基化,但在MEF中高甲基化(圖2e)。然而,Oct4和Nanog的啟動子在這三種細胞類型中都是高甲基化的(圖2e),這與這些細胞中多能性基因表達量很少的結果是一致的。

圖2 ptf1a重編程的NSC特征分析

        Six3是一個前腦腹側和視網膜前體細胞的標志性TF。作者通過semi-qRT-PCR和qRT-PCR發現,與MEF相比,ptf1a重編程的miNSC中Six3表達明顯增加。Six3-Cre轉基因小鼠與R26R-YFP報告小鼠雜交胚胎分離培養的MEF被Ptf1a慢病毒感染后,它形成了含有許多黃色熒光蛋白(YFP)和Nestin都呈陽性的神經球,這表明Ptf1a可能誘發前腦和視網膜前體細胞的一些干細胞特征。

        為了進一步確認這些miNSC的NSC身份,作者對miNSC10、SCR029和MEF細胞進行了RNA-seq分析。miNSC10、SCR029和MEF細胞中基因表達水平的散點圖顯示,miNSC10和SCR209細胞的基因表達水平相似,但均與MEF存在顯著差異(圖3a-c)。與這些結果一致的是,聚類分析也顯示出miNSC10和SCR029細胞之間有很高的相似性,但它們與MEF之間有很大的差異(圖3d)。與MEF相比,miNSC中有許多基因表達水平下調或上調(圖3e)。作者對上調基因進行基因集富集分析(GSEA),發現了兩組主要的富集基因GO term(圖3f)。其中一組在與神經發育相關的GO term中富集,如神經發生、神經元分化、神經系統發育、神經發生調節、大腦發育和軸突發生。另一組富集在細胞分裂GO term,包括細胞分裂、有絲分裂細胞周期、核分裂、姐妹染色單體分離、細胞周期調控。這些數據與miNSC作為NSC及其增殖和自我更新能力是一致的。與此一致的是,進一步的分析顯示,盡管有一定的差異,但miNSC10、SCR029、NS528(小鼠ES細胞來源的NSC)和ciNSC10 (化學誘導MEF形成的NSC)細胞之間的相似性比MEF更大。

圖3 iNSC、對照NSC和MEF的基因表達圖譜

        Ptf1a在分裂的胰腺原基中表達,在產生多潛能胰腺前體細胞中起重要作用。此外,胰腺干細胞和NSC均特征性表達Nestin。因此,ptf1a重編程的miNSC也可能可以代表胰腺干細胞。作者通過semi-qRT-PCR檢測胰腺前體細胞和分化細胞的一系列標志物,發現均未在miNSC中表達,排除了ptf1a重編程miNSC可以作為胰腺干細胞的可能性。

3.Ptf1a重編程miNSC的三能性

        作者想要解決的問題是由非神經前體細胞TF Ptf1a重編程的miNSC是否可以與NSC 一樣,具有分化成神經元、星形膠質細胞和少突膠質細胞的潛力(圖4a)。當在神經分化培養基中培養時,短短幾天內,miNSC就發生了穩健的形態學變化,細胞體積變小、普遍的神經突擴張(圖4b)。在培養的2-3周,許多細胞分化為Tuj1、Map2、Dcx、NeuN、Tau、peripherin或GABA免疫的神經元(圖4c)。3周時的定量顯示,83.3%的細胞呈Tuj1陽性(圖4e)。此外,不同miNSC細胞系(miNSC5、10、12)顯示類似的分化成Tuj1或Map2免疫的神經元的能力(補充圖8)。在星形膠質細胞分化條件下,87.2%的分化細胞形成神經膠質原纖維酸性蛋白(GFAP)免疫的星形膠質細胞(圖4 c,e),少突膠質細胞分化培養基中,miNSC能夠分化為O1、CNP或MBP免疫的少突膠質細胞,而26.6%的分化細胞為O1陽性(圖4 c,e)。因此,ptf1a重編程的miNSC具有三能性,能夠分化為神經元、星形膠質細胞和少突膠質細胞。

        通過突觸素染色標記試驗、電生理特性分析表明了miNSC分化的神經元具有活性膜特性(圖4d、f-j)。因此,ptf1a重編程的miNSC能夠分化為功能神經元。

圖4 ptf1a重編程的NSC的體外分化潛能

        作者評估了ptf1a重編程的miNSC在體內分化成三種細胞系的潛能。將GFP標記的miNSC慢病毒注射入成年小鼠海馬區,通過一系列免疫標記試驗表明,ptf1a重編程的miNSC具有在體內分化為三種神經細胞和膠質細胞的多能性(圖5)。另外,作者觀察到分化的神經元形成具有典型的頭-頸結構的成熟樹突棘,它們的樹突可以直接接觸周圍宿主細胞的多個突出蛋白陽性的突觸前端(圖5),這表明miNSC分化的神經元可以形成突觸連接和功能性集成到現有的神經元回路。

圖5 ptf1a重編程的NSC的體內分化潛能

4.miNSC對AD模型的治療效果

        鑒于ptf1a誘導的miNSC在體內具有活性和三種分化潛能,作者檢測了移植的miNSC是否對治療小鼠神經退行性疾病模型有療效。將GFP標記的miNSC移植到APP/PS1 AD小鼠模型的海馬區中。移植一個月后,作者進行了一系列行為學試驗來評估移植動物的認知功能(圖6a)。在筑巢試驗中,注射生理鹽水和miNSC的小鼠的巢質量沒有差異(圖6b)。在曠場試驗中,兩組小鼠的運動總距離或中央區域停留時間也沒有差異(圖6c)。

        為了研究學習記憶行為,進行了新物體識別試驗、Y迷宮試驗和Morris水迷宮試驗。結果表明,對照和miNSC注射小鼠在新物體識別試驗中花費在新物體上的時間沒有差異,在Y迷宮試驗中正確自發性交替(SAP)的總百分比沒有差異(圖6 d,e)。然而,Morris水迷宮試驗表明,在試驗第6天,miNSC移植小鼠相比于對照組平均逃避潛伏期明顯降低(圖6),并且這些移植小鼠在目標象限的逗留時間更長(圖6f)。此外,移植小鼠似乎對目標平臺位置有偏好,但這一偏好沒有達到統計學意義(圖6f)。綜上所述,這些結果表明移植的miNSC可以顯著提高APP/PS1 AD小鼠模型的空間學習和記憶能力。

        作者也評估了miNSC對β-淀粉樣蛋白1-40(Aβ1-40)損傷AD小鼠模型的治療潛力。首先確定了Aβ1-40損傷小鼠的學習和記憶障礙小鼠與AD類似。將GFP標記的miNSC在注射Aβ1-40 2周后移植到相同位置。兩個月后,作者進行了同樣的行為學試驗,發現移植miNSC可以顯著提高APP / PS1和Aβ1-40損傷AD小鼠模型的空間學習和記憶能力,療效與ESC來源的NSC相似(圖6g-k)。

圖6 移植miNSC對APP / PS1和Aβ1-40損傷AD小鼠模型的療效

5.Ptf1a重編程對Rbpj互作的依賴性

        先前有研究表明,Ptf1a與Rbpj、E-蛋白以非Notch信號依賴性方式形成DNA結合三聚體,以特化胰腺細胞系和GABA能神經元。作者研究了Ptf1a和Rbpj之間非Notch信號依賴性的互作是否也是Ptf1a重編程所需要的。在MEF中,WB和免疫共沉淀結果顯示,Rbpj蛋白是內源性表達,外源性表達的Ptf1a可以免疫共沉淀Rbpj。將Dox可誘導的 Ptf1aW298A(此突變體中Ptf1a與Rbpj的互作被破壞,但仍可與E-蛋白結合)慢病毒注射到MEF中,在注射6天后,沒有發生典型形態變化以形成細胞群落,只在9—14天產生了少數類似正常形態神經球的群落,而注射了野生型Ptf1a病毒的MEF則在在9—14天,在12孔板中每板產生了數以百計的神經球(圖7 b,c)。類似地,MEF感染Ptf1aW298A慢病毒后未能表達NSC標志蛋白質Sox2、Pax6或Nestin(圖7 d)。因此,與Rbpj的互作是Ptf1a重編程的先決條件。與此一致的是,敲除MEF中Rbpj的表達后,ptf1a誘導的神經球的數量減少了兩倍多(圖7e-g)。

圖7 Ptf1a重編程依賴于與Rbpj的Notch信號非依賴性互作

6.TF和Notch信號調節iNSC內穩態

        miNSC10 iNSC和SCR029 NSC的ATAC-seq結果表明,peak關聯基因富集在神經發生、神經元發育、大腦發育、膠質細胞發育(圖8a, b),與NSC特征一致。在peak峰值中心300 bp窗口中鑒定新motif,說明miNSC10和SCR029細胞都富集了類似的屬于多個TF家族的TF結合motif,TF家族包括Sox、bHLH (Ebox)、Pou3f、homeobox、Nfi和Rfx(圖8c)。相應地,RNA-seq數據顯示,與MEF相比,這些TF基因家族的多個成員在miNSC10和SCR029細胞中上調或高表達。qRT-PCR證明,除了Sox2之外,Sox5、6、8、21在miNSC10和SCR029細胞中均表達上調。一般來說,miNSC10細胞的ATAC-seq圖譜與SCR029細胞相似,但與MEF完全不同;而對于上調的TF基因,如Olig2(bHLH)、Sox2、Pou3f2/Brn2、Pax6 (homeobox),與MEF相比,miNSC10和SCR029細胞中這些位點具有更多的峰和/或差異峰(圖8d-g),說明更開放的染色質結構增加了基因表達。

        與最富集的基序相對應的6個TF家族都有助于維持NSC穩態,如NSC狀態特化、自我更新、預防靜止和神經分化(圖8h)。NSC的特化和維持需要Sox2。它通過與第3類POU域TF的互作遠端增強子結合,特別是p3f2,它也涉及到ESC特化為神經細胞系。Olig2通過激活促增殖基因來促進NSC自我更新,同時通過抑制參與神經元過早分化和干細胞靜止這些過程的基因來抑制這些過程。Pax6是一種眾所周知的同源盒TF,對于NSC的特化、自我更新、多能性和神經發生至關重要。Lhx2同源盒TF通過激活Pax6的表達,同時減弱骨形態發生蛋白(BMP)和Wnt信號,從而在NSC特化中發揮作用。Nfi和Rfx家族成員已被證明與Sox2和Pou3f2共同占據基因組位點,對中樞神經系統發育和靜止狀態至關重要。

圖8 iNSC和NSC的染色質可接近性和基因表達

        Notch信號是一種典型的細胞接觸依賴性信號通路,是NSC增殖和自我更新所需的信號通路,也是防止NSC不及時的神經分化所必需的信號通路。RNA-seq數據表明,相比于MEF,miNSC10和SCR029細胞中Notch信號相關基因Notch1、Dll1、Hes1和Hey1均顯著上調,并且這些位點也顯示出差異的ATAC-seq圖譜,說明miNSC和NSC中的Notch信號均被激活以促進其更新和維持。與Notch1、Dll1和Hes1基因的上調一致,它們的啟動子與MEF相比,在miNSC10和SCR029細胞中被低甲基化。qRT-PCR實驗還表明,Ptf1a誘導的MEF中Notch1、Dll1和Hes1的表達具有時間依賴性,但對Rbpj表達無影響。為了確定Notch信號是否參與Ptf1a重編程MEF形成的神經球的自我更新和維持,作者在重編程過程中應用了Notch信號抑制劑DAPT。作者發現DAPT不僅減少了神經球的數量,而且對Notch信號效應基因Hes1和Hes5的下調作用具有劑量依賴性,說明Ptf1a可以激活Notch信號通路,而Notch信號通路又是Ptf1a重編程的miNSC自我更新和維持所需要的。

7.Ptf1a將人成纖維細胞重編程為iNSC

        使用類似于MEF重編程的方法,作者通過Dox可誘導的Ptf1a慢病毒的感染,從人包皮成纖維細胞(HFF)中生成神經球(圖9a, b)。只有在沒有Dox的條件下擴增和傳代時,才能獲得完整的單層hiNSC(圖9c,d)。無Dox傳代到20代時,開始停止形成任何神經球,而Dox的存在時,傳代到32代時仍可產生許多神經球,這表明Dox可誘導的外源Ptf1a對典型的單層iNSC生成有抑制作用。qRT-PCR試驗表明,在缺乏Dox的hiNSC中NSC標志物SOX2、PAX6、OLIG2、NESTIN的表達水平比含有Dox的高幾倍,解釋了為什么缺乏Dox的hiNSC表現得更像典型的NSC。值得注意的是,在沒有Dox的情況下,hiNSC中內源性PTF1a的表達水平比Dox存在時更高。

        根據qRT-PCR結果,ptf1a重編程的hiNSC幾乎不表達多能性基因OCT4和NANOG。相反,它們高表達NSC標志蛋白,包括SOX2、PAX6、NESTIN、OLIG2和FABP7(圖9 e-i)。體外分化試驗表明hiNSC具有三能性(圖9p,j-n)因此,Ptf1a具有類似的活性,可將人類成纖維細胞重編程形成三能性NSC。作者通過突觸素染色標記試驗、電生理特性分析表明,ptf1a重編程的miNSC能夠分化為功能神經元(圖9q,r-u)。

        作者進一步研究了ptf1a重編程hiNSC在體內分化成神經和膠質細胞系的潛力。將帶GFP標記的hiNSC移植到成年小鼠海馬區,發現ptf1a重編程的hiNSC在體外和體內都具有分化成神經和膠質細胞系的多能性。

圖9 Ptf1a將人成纖維細胞重編程為iNSC

        目前,人類胚胎干細胞或誘導性多能干細胞的臨床應用受到其致瘤風險的影響。相比之下,神經干細胞(NSC)被證明是一種不容易發生腫瘤的安全細胞來源,因此為患者特異性細胞替代療法提供了強有力的策略,并為藥物發現和體外疾病建模提供了有用的工具。

        在這項研究中,通過miNSC10、SCR029和MEF的RNA-seq基因的表達水平和功能確認了miNSC的NSC身份。且相比于MEF,miNSC10和SCR029細胞中Notch信號相關基因均顯著上調,并且這些位點也顯示出差異的ATAC-seq圖譜,說明miNSC和NSC中的Notch信號均被激活以促進其更新和維持。并且采用抑制劑DAPT抑制Notch信號后Hes1和Hes5表達下調,說明Ptf1a可以激活Notch信號通路,且Notch信號也作用于Ptf1a重編程的miNSC自我更新和維持。

        總而言之,文章數據表明非神經前體細胞TF Ptf1a可獨立將小鼠和人類成纖維細胞成功地重編程為iNSC,其具有三能性,能夠高效分化為功能性神經元、星形膠質細胞和少突膠質細胞,并可在移植后改善AD小鼠模型的認知障礙。

作者簡介

向孟清
中山大學中山眼科中心眼科學國家重點實驗室課題組長,博士,教授,博士生導師。研究方向:視網膜發育、再生和發病的分子機理和基因調控網絡研究、視網膜和神經干細胞的研究。領導課題組獲得了多項重大原創性和系統性的成果以及多項榮譽和獎勵,其中包括Basil O’Connor起步學者研究獎,Sinsheimer學者獎,Wolf, Block, Schorr and Solis-Cohen, LLP聽覺科學獎等。現已在Neuron、PNAS、J Neurosci、Development等國際知名雜志上發表學術論文60余篇,在視網膜和感覺神經發育等研究領域處于世界領先地位。

肖冬長(第一作者)

2013-2018年就讀于中山大學中山眼科中心分子醫學專業,期間參與多項課題,并已發表或者接收4篇SCI,包括Nature communications, Molecular brain,Frontiers in neuroscience和Developmental Neurobiology,并參與一項國家專利。

參考文獻

Dongchang Xiao, Mengqing Xiang, et al. Direct reprogramming of fibroblasts into neural stem cells by single non-neural progenitor transcription factor Ptf1a. Nature Communications. 2018,9:2865.

 

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