QTL讓基因無處可藏!紅椒也曾是青椒,青椒顏色大不同

葉綠體在光合作用以及激素、維生素、類胡蘿卜素、氨基酸以及脂肪酸等重要物質的合成代謝中扮演重要角色,而葉綠體的發育受到核基因與葉綠體基因協同互作調節。迄今為止,大部分有關葉綠體發育的生理及遺傳調控研究都集中于葉片,而對于果實中調控葉綠體發育的研究幾乎為零。果實中同樣存在光合元件并且十分活躍,然而,一般認為果實中大部分光合產物是由葉片轉運而來。

番茄一直被視為研究果肉發育的模式植物,然而,大多研究集中于果實成熟的調控。有一些基因被認為調控果實葉綠體發育,例如,GLK2是葉片與果實組織葉綠體發育的正調控因子,通過激活光合相關基因的表達來調控葉綠體發育;在野生型番茄中,SlGLK2及其他光合、葉綠體相關基因呈現梯度表達,在幼嫩果實中常呈現“綠肩”表型。另一個相關轉錄因子APRR2-LIKE在調控葉綠體發育中,與SlGLK2表現相似功能。其他一些正向或負向調控因子,如BEL-LIKE HOMEODOMAIN 11SlARF10DET1等。

辣椒在幼果果色及葉綠素含量方面存在豐富自然變異,控制這種變異的第一個基因是APRR2-LIKE,其功能缺失會降低葉綠素含量并出現白色幼果。Brand?et al., 2012利用遺傳群體定位到兩個控制葉綠素含量的主效QTL,pc8.1pc10.1,研究發現CaGLK2pc10.1共分離,并調控葉綠素含量,暗示CaGLK2pc10.1的靶標基因,而對于pc8.1的靶標基因還不清楚。

今天給大家分享一篇由以色列與美國科學家合作完成的一項研究“The zinc-finger transcription factor CcLOL1?controls chloroplast development and immature pepper fruit color in Capsicum chinense?and its function is conserved in tomato”。該研究對QTL?pc8.1(即pc1)進行解析,利用BSA-Seq、BSR-Seq、交換單株篩選、DEGs分析、CRISPR等方法定位并證明辣椒鋅指轉錄因子CcLOL1是此QTL的靶標基因。研究發現,該基因以果實特異性方式控制葉綠體大小與葉綠素含量,并且在番茄果實中它的同源基因是保守的。

 

?圖1. 親本:C. annuum?1154與C. chinense?PI 152225(Brand et al., 2012)

材料與方法

1. 群體構建:1154(深綠;C. annuum),PI 152225(淡綠;C. chinense);86-45(BC4F3 NIL,含來自PI152225的pc1區段)(圖 1.及圖 2.)

圖2. 群體構建流程圖

2. BSA-Seq:F2群體(1154 × NIL 86-45)混池——30個(淡綠果色的葉片)+30個(深綠果色的葉片),每個混池測序深度20×,PE150,Illumina HiSeq 4000;參考基因組—— CM334 v. 1.55 (Kim et al., 2014)

3. BSR-Seq:1154與PI 152225以及2個F2群體(1154 × NIL 86-45)極端混池——每個親本或混池各取15個單株,每個單株取3個幼果,設3個生物學重復;SE60,Illumina HiSeq 2500;參考基因組—— CM334 v. 1.6 (Kim et al., 2017)

4. QTL-NILs差異表達分析: NIL-1973, NIL-1975, NIL-1976與親本 (1154與PI 152225);取樣時間為授粉后10天與30天, 3個生物學重復;Illumina HiSeq 4000 single-read sequencing technology

5. 色素含量、白利度及成熟果實重量考察

6. 葉綠體結構觀察:Leica SP8激光共聚焦顯微鏡 (Leica, Wetzlar, Germany);檢測葉綠體面積與單位面積葉綠體數目

7. CRISPR/Cas9:敲除番茄基因Solyc08g077060 (tomato ortholog of CcLOL1),獲得基因敲除株系lol1CR-25、lol1CR-43、lol1CR-57與lol1CR-58

8. 品種:C. annuum accessions——1154;C. annuum var glabriusculum accessions——Cora, Nayoi and 1202;C. chinense accessions——CA4, USDA 162, 170, 174-3, 164-3, 180-2, PI 159236, 187-2, 4, 165-2

結果與分析

BSA-Seq分析pc1區域)

為確定pc1在基因組中的具體位置,本研究利用F2群體(1154 × NIL 86-45)極端混池進行BSA-Seq分析,通過與參考基因組CM334 v. 1.55比對,混池間共檢測出14805個SNPs,其中,有8235個SNPs分布在Chr.1上; 另外還有5670個SNPs位于4條未被組裝的scaffolds上(scaffold1362, scaffold1381,scaffold1659與scaffold799),有趣的是,這些scaffolds上的番茄同源基因與辣椒Chr.1存在共線性。SNPs在Chr.1上分布特點是從0M-16M SNP數目逐漸增加,到17M后SNP數目突降,暗示滲入的QTL等位區段終止于這個位置。以上結果表明,pc1定位在Chr.1的SNP峰值區或者富含SNPs的未被組裝的scaffolds上(圖3.a)。

圖3. 混池間SNPs分布(a. BSA-seq與b. BSR-seq)及pc1區域物理圖譜(c.)
重組分析pc1區域)

為進一步精細定位pc1,本研究對624個F2(1154 × NIL 86-45)單株標記分型以篩選QTL區域內的交換單株。基于前期研究,標記T1341與QTL peak連鎖最為緊密 (Brand et al., 2012),作者又在T1341附近開發出6個標記,在標記F23與H05間,共篩選出34個F4交換單株,可代表6種基因型組合,橫跨Chr.1:5cM的區間。為排除pc1pc10互作的影響,作者將所有交換單株的CaGLK2固定為1154等位基因。結果分析暗示,F23與LOL1是與QTL連鎖最為緊密的標記,因為line 15含PI 152225最短的導入片段且葉綠素含量顯著低于1154,而line 260在這2個標記間含1154等位且與1154葉綠素含量沒有顯著性差異。此外,lines 53與260在APRR2-like位點含有PI 152225等位,葉綠素含量卻與1154沒有顯著差異,暗示此基因(APRR2)在本研究中的遺傳背景下不影響葉綠素含量(表1.)。

CM334 v. 1.6 (Kim et al., 2017)已將上述4個scaffolds(scaffold1362,scaffold1381,scaffold1659與scaffold799)整合進Chr.1中,通過pc1區域的標記比對,F23到H05區間大小為2Mbp。

表1. pc1區域標記基因型與辣椒幼果葉綠素含量(雙親與6個重組系)
pc1?果實特異性方式調控葉綠體區室大小與葉綠素含量

為確定pc1對果實發育的影響,本研究對line 1154(深綠NIL)與15(淡綠NIL)的葉綠體參數進行考察。葉綠素含量測定結果顯示,1154與15在綠色辣椒幼果中存在顯著差異(圖 4.a,b),而在葉片中沒有顯著差異(圖 4.c);激光共聚焦顯微鏡觀察發現,與1154相比,line 15綠色幼果的葉綠體較小且具有較少的葉綠體數目(圖 4.d,e)。這些結果暗示pc1通過調控葉綠素含量以及葉綠體大小來影響辣椒幼果顏色。

為考察幼果期葉綠體發育差異是否會影響成熟期果實特征,作者又比較了1154與15的幾個成熟果實特征。結果顯示,果實重量與白利度在兩者間并無不同(圖 4.f,g),然而,1154比15擁有更高的類胡蘿卜素素總量(圖 4.h)。

圖?4. QTL- NILs(pc1)葉綠素含量、葉綠體大小以及成熟果實特征.
BSR-Seq分析pc1區域)

為識別QTL區候選基因,解析其分子及細胞學機制,本研究對雙親(1154與PI 152225)及兩個極端混池(1154 × NIL 86-45)進行轉錄組分析。BSR-Seq得到21.2,21,21.9與21.2 M個reads(1154,dark-green bulk,light-green bulk與PI 152225),共分析得到4114個純合SNPs,其中2264個SNPs定位在Chr.1。SNPs分布峰值區間位于Chr.1:8 Mbp區間(即,13-21 Mbp;CM334 v.1.6),峰值中心落在18 Mbp(圖3b,c),而在21.6 Mbp的位置SNPs數目突降。BSA-Seq (圖 3a)與BSR-Seq (圖 3b)比較發現,QTL峰值位點與SNP突降位置出現一個遷移,這是因為所用參考基因組不同所致,前者是CM334 v. 1.55(Kim et al., 2014),后者為CM334 v. 1.6 (Kim et al., 2017)。

差異表達候選基因分析(pc1

與淡綠色親本與混池對照相比,在1154與深綠色混池間共有240個基因發生上調表達,284個基因下調表達。

綜合考慮重組交換(表1.),BSA-Seq與BSR-Seq(圖3.)分析,本研究將QTL區間錨定在2.2 Mbp(19.4-21.6 Mbp),此區間共包含51個基因,其中,有11個基因在混池間發生差異性表達。深綠色混池中3個上調表達基因可能與葉綠體發育相關,因而被視為候選基因進行下一步分析。經過分析,第一個基因CA00g61750與第二個基因CA00g77840或與葉綠素含量不相關或表達量無顯著差異,因而被排除;第三個基因CA00g77830,鋅指轉錄因子LOL1,是擬南芥脅迫誘導細胞死亡的正調控因子,并且它的水稻同源基因過表達可提高葉綠素b含量,此外,CA00g77830在綠色組織高度表達,而在成熟果實中表達減少,暗示此基因在調控葉綠素含量方面發揮重要功能。

第四個差異表達基因CA00g77800,編碼MIP1蛋白,在深綠色混池及親本中呈下調表達。MIP1是否調控葉綠素含量并不清楚,但是擬南芥數據庫STRING蛋白互作網絡預測顯示LOL1與MIP1存在互作。此外,MIP1在葉片與莖中表達量很低,在果實中表達量相對較高,并在成熟果實中達到最高,然而,在成熟期表達水平不變。

pc1?參與調控辣椒幼果的光合與氧化還原過程

為研究pc1參與影響的細胞學過程,本研究對混池間983個差異表達基因進行GO富集分析并根據生物過程進行分類(圖5)。最顯著的GO term過程與光合作用及氧化還原有關,這兩個過程包含184個DEGs,被分成17個亞類,其中最大的一類是氧化還原過程。這一類基因與葉綠素合成下調有關,例如,PORCAOHEMA1,還與葉綠素降解基因上調有關,例如,CA00g73130,暗示葉綠素合成與降解受這個QTL調控。另一類重要基因,包含Chlorophyll a/b-結合蛋白的多個成員基因(CA01g17090,CA02g12050,CA02g12060,CA02g12070等),在淡綠混池中下調表達,它們參與光合、蛋白發色團及光刺激響應等過程。另外,若干與碳固定有關的Rbc家族基因在淡綠混池中也呈現下調表達。

多個DEGs的上調或下調表達與氧化脅迫或細胞氧化還原穩態相關,例如,CA03g06870 (Superoxide dismutase),CA10g19020 (Thioredoxin),CA00g63370 (Dihydrolipoyl dehydrogenase)等。此外,其它重要過程包括碳水化合物代謝、脂質代謝、次級代謝、類黃酮合成以及DNA復制。

圖?5. 混池間差異表達基因的GO生物過程分類(FDR ≤ 0.05).
CcLOL1CcMIP1C. chinense?PI 152225中發生移碼突變

對1154與PI 152225中的CcLOL1 ORF測序分析發現,在PI 152225中26bp處存在單堿基C的插入,引起移碼突變,在第19個氨基酸處造成提前終止,在line 15中包含同樣的突變;而在C. annuumC. annuum?var glabriusculum中雖然葉綠素含量變異顯著,但是它們的CcLOL1?ORF序列均與1154相同。因此,作者又進一步分析了CcLOL1在12個品種中表達情況與葉綠素關系,然而,兩者之間的相關系數并不顯著。

對1154與PI 152225中的CcMIP1 ORF測序分析發現,在PI 152225中570 bp處存在32 bp的插入,引起移碼突變,在第209個氨基酸處造成提前終止。除了C.annuum?var glabriusculum?lines Nayoi與1202在相同位置有32 bp插入之外,其它品種CcMIP1序列均與1154一致。

C. chinense幼果果色變異遺傳位點等位多樣性分析

由于在PI 152225中CcLOL1CcMIP1CaGLK2都是突變等位,因此作者又對另外10個C. chinense品種測序分析這3個基因以及CcAPRR2以求獲得等位多樣性并分析出它們與葉綠素含量的關系。結果暗示極端淡綠果色的3個基因(CcLOL1、CcAPRR2、CaGLK2)均是突變等位,而C. annuum 1154在這些位點都是野生型等位基因。對于葉綠素含量中等的一些品種,3個基因其中有1個為突變等位:CcLOL1?(164-3,180-2,PI 159236與CA4),CaGLK2(lines 187-4與USDA 162)與CcAPRR2(line 187-2)。深綠果色品種165-2突變CcAPRR2后,會引起葉綠素含量降低;而被誘變后幼果葉綠素含量變化并不一致,暗示CcMIP1其獨立于CcLOL1

CRISPR/Cas9敲除番茄基因SlLOL1?導致幼果呈淡綠色

為證明CcLOL1參與調控葉綠體發育與葉綠素含量,本研究利用CRISPR/Cas9技術敲除番茄栽培種MP1中的辣椒同源基因Solyc08g077060SlLOL1)獲得突變體。首先設計兩個gRNAs靶定exon 2,兩者相距91 bp;然后遺傳轉化番茄MP1,經陽性苗篩選,檢測,最終獲得4類突變體lol1CR-25lol1CR-43lol1CR-57lol1CR-58,或缺失,或插入,經T1與T2代測序驗證獲得純合突變體(圖 6.a,b)。

與MP1相比,突變體幼果顏色明顯變淺,尤其是近端肩區(圖6.c);并且無論是近端區還是遠端區,果實中葉綠素含量顯著降低(圖 6.d,e)。然而,在成熟葉片中葉綠素含量沒有變化,SlLOL1以果實特異性方式調控葉綠素含量。為了檢測葉綠素含量降低是否是由葉綠體變小所致,作者分析了lol1CR-43與MP1幼果近肩區果皮中葉綠體面積與數目。結果顯示,lol1CR-43中葉綠體顯著變小,也就是說突變體中葉綠體面積與數目明顯低于MP1(圖 6.g,h)。

圖?6. CRISPR/Cas9敲除番茄基因SlLOL1導致幼果葉綠素含量降低
pc1pc10?互作影響辣椒幼果葉綠素含量

為分析pc1pc10對葉綠素含量的影響,本研究利用QTL-NILs 1976,1975與1973(分別突變pc1pc10以及pc1pc10)進行比較分析。與1154相比,NIL-1975 and NIL-1976 葉綠素含量分別降低49%與41%,而NIL-1973降低33%;雙QTL突變NIL-1973效應比期望值(90%)顯著小,暗示pc1pc10間的互作呈現非加性效應(圖7.a,b)

為檢測CcLOL1CaGLK2表達水平是否相互影響,作者分析了不同NILs在幼果發育的兩個時期CcLOL1CaGLK2以及CcAPRR2CcMIP1的表達情況。結果顯示,CcLOL1的表達水平不受CaGLK2?(NIL 1975)突變的影響,并且在NILs 1976與973中表達水平相似;相似地,CaGLK2的表達不受CcLOL1CcMIP1?(NIL 1976)突變的影響,并且在NILs 1975與1973中表達水平相似;這些結果暗示了CcLOL1CaGLK2的表達彼此獨立。CcAPRR2在NILs 1975與1973授粉后30天表達上調,但是在NIL 1976中不受影響,暗示CaGLK2CcAPRR2有抑制作用。需要說明的是,?CcMIP1CcLOL1緊密連鎖(相距77 Kbp),因此兩個基因突變等位一起被回交到NILs 1973與1976中。此外,CcMIP1僅在NILs 1973與1976授粉30天后上調表達,且在混池間呈現相似表達模式,說明此基因表達不受CaGLK2影響。

圖?7. pc1pc10-NILs幼果葉綠素含量(分別突變CcLOL1CaGLK2).

結論

1. CcLOL1即為pc1靶標基因,調控辣椒果實中葉綠體大小與葉綠素含量變異

2. CcLOL1主要調控C. chinense幼果果色變異,而對于C. annuum調控能力有限

3. CcLOL1,CaGLK2CcAPRR2是高度分化的并與C. chinense與C. annuum var glabriusculum幼果果色相關

4. pc1與pc10功能彼此互補,而CcLOL1與CaGLK2的表達互不影響

研究思路總結

利用近等基因系與輪回親本雜交獲得F2,然后混池測序,即BSA-Seq與BSR-Seq,結合候選區域交換單株篩選,尋找重組斷點,轉錄組分析差異表達基因,分析與目標性狀相關候選基因,同時分析品種間候選基因序列變異與表型變異之間的關聯性,接著,CRISPR敲除候選基因驗證功能,最后,考察表型相關指標與QTL或基因互作模式之間的相關性。

 

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參考文獻:

Borovsky, Y., Monsonego, N., Mohan V. et al.?(2019) The zinc-finger transcription factor CcLOL1 controls chloroplast development and immature pepper fruit color in Capsicum chinense and its function is conserved in tomato. Plant J.?doi: 10.1111/tpj.14305.

Brand, A., Borovsky, Y., Meir, S. et al.?(2012) pc8.1, a major QTL for pigment content in pepper fruit, is associated with variation in plastid compartment size. Planta, 235, 579-588.

Brand, A., Borovsky, Y., Hill, T. et al.?(2014) CaGLK2 regulates natural variation of chlorophyll content and fruit color in pepper fruit. Theor. Appl. Genet. 127, 2139–2148.

Kim, S., Park, M., Yeom, S.-I. et al.?(2014) Genome sequence of the hot pepper provides insights into the evolution of pungency in Capsicum species. Nature Genet. 46, 270-278.

Kim, S., Park, J., Yeom, S.-I. et al.?(2017) New reference genome sequences of hot pepper reveal the massive evolution of plant disease-resistance genes by retroduplication. Genome Biol. 18, 210.

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