淺談基因測序

1869年,Friedrich Miescher 發現和分離出脫氧核糖核苷酸,人類對生命的研究開始向分子方向啟程,自1977年Sanger發明了雙脫氧鏈終止法一代測序技術開始,涌現出GS FLX,Solexa,SOLID,PicBio,Oxford Nanopore Technologies(ONT)多種測序平臺,測序技術發展至今已有四十多年時間,而每次新興平臺的出現,無不顯現出生物領域人類文明的又一次大的向前邁步,是人類科技奮斗史中的里程碑。而也正是一代代測序技術的發展和我們一代代科學家不斷努力,測序技術被不斷應用于基因組組裝,功能基因定位,進化分析,育種以及精準醫療等領域,為人類的生活帶來一次次便利的同時也帶來了無限可能。

第一代測序技術應用了Sanger雙脫氧鏈終止法,它的讀長可達1000bp,準確率高達99.999%,但測序前需要對特定區段進行引物設計且通量低,很難應用于組學方面的研究。基于此特點,涌現出二代測序技術,它主要的特點為短讀長,高通量。以Illumina?Solexa為例,它采用邊測序邊合成的方法,首先利用超聲波將DNA打斷成200-500bp小片段文庫,加接頭后DNA片段隨機附著于flowcell表面,經過橋式PCR擴增形成“DNA簇”,實現堿基信號強度放大,采用邊合成邊測序的方法,進行全基因組全面,準確的測序。

 

圖1? NovaSeq 6000

百邁客目前主要應用2017年Illumina平臺推出的NovaSeq系列測序平臺,雖然較于以往二代平臺,它的測序質量值、Index的測序識別、DNA文庫冗余度等指標有了明顯提升,但無法克服短讀長的reads 在基因組組裝、大片段變異檢測、轉錄組、甲基化等研究中的短板。基于此情況,三代測序應運而生。

目前,三代測序的主要代表為PicBio和Oxford Nanopore Technologies(ONT)這兩大測序平臺,以ONT平臺為例,它主要通過電信號識別堿基序列,單鏈DNA/RNA通過納米孔(蛋白通道),不同的堿基會形成特征性離子電流變化信號,通過對這些信號的檢測,得到堿基序列,完成測序。與二代相比,它主要的優勢在于在測序前,不會將DNA樣品打斷成小片段,而是對我們提取DNA進行片段篩選,一般篩選10-100kb大小的片段進行測序,這就對我們前期提取的DNA質量要求較高。

三代測序技術的出現,為復雜的多倍體基因組組裝帶來了福音。這種基因組由于倍性多,重復序列高,而二代測序局限于產生單倍體間的共有序列,導致此類物種的研究停滯不前。而ONT平臺由于其長讀長,跨越完整的重復區域,大的結構變異也得到了很好的檢測。eg. 納米孔測序技術可以將T-DNA結構的分辨率提升到36Kb。這就意味著,在這類突變體功能基因定位時,可以直接通過測序的方式,找到材料中T-DNA的插入位置及拷貝數,從而找到功能基因,實現基因克隆。和傳統的圖位克隆比較,將大大縮短定位周期。傳統的自然突變材料,如果已經有定位區段,應用二代檢測SNP,ONT檢測SV的方式可以讓我們的功能基因克隆方面事半功倍。

在基因組組裝方面,以生菜基因組為例,短讀長的二代測序組裝出21116個contig和2.21G的基因組,基于ONT平臺,則產生了1169個contig,contig N50為7.3Mb。二代數據產生了想較于三代數據18倍的contig用于基因組組裝,而三代平臺讀長的優勢為高質量的基因組組裝提供了便利。在轉錄組研究方面,ONT平臺的長讀長可以為我們帶來完整的轉錄異構體的序列,且可做定量研究,這將避免二代短片段數據在轉錄本組裝上的錯誤,更好的應用于轉錄組研究。

ONT做為新一代測序技術,已逐漸廣泛應用于科學研究中。百邁客一直致力于ONT平臺的探索與研發,目前擁有MinION、GridION X5、PromethION等多種3代測序平臺,且積累了豐富的項目經驗,期待你的加入哦~

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