三代測序,我們一直在路上!

自1977年Sanger發明了雙脫氧鏈終止法測序技術以來,新的測序技術、測序平臺不斷涌現。目前,三代測序技術已憑借其技術優勢受到越來越多科研工作者的青睞。三代測序技術集長讀長和高通量于一身,對高純度、長讀長核酸分子進行實時測序,此技術已廣泛應用于科學研究及精準醫療中。三代測序的代表為Oxford Nanopore Technologies(ONT)和PicBio(PB)這兩大測序平臺,下面就這兩個平臺與大家說道說道:

測序原理

ONT測序將人工合成的一種多聚合物的膜浸在離子溶液中,多聚合物膜上布滿了經改造的穿膜孔的跨膜通道蛋白(納米孔),也就是Reader蛋白,在膜兩側施加不同的電壓產生電壓差,DNA鏈在馬達蛋白的牽引下,解螺旋通過納米孔蛋白,不同的堿基會形成特征性離子電流變化信號,通過對這些信號的檢測,得到堿基序列,完成測序。

PB的測序空間為ZMW(zero-mode wave guides,零模波導孔),外徑100多納米,DNA分子掉入孔中,不同熒光標記的脫氧核苷酸在聚合酶的作用下,會產生不同的熒光信號,隨后標記基團自動脫落,維持了信號的持續監測。激光從ZMW底部打入,由于孔直徑很小而不能穿過孔進入上方溶液區,從而把背景噪音降到最低。

由此,ONT的納米孔是指膜上的納米孔通道蛋白,PB的納米孔為ZMW孔,在“方寸之地”完成測序。

PB測序

ONT測序
測序儀器

ONT平臺:MinION、GridION X5、PromethION;具體區別如下:

PB平臺:RSII和Sequel系列儀器,目前Sequel系列平臺測序通量高、單Gb數據成本低、周期短的特點已將RSII平臺取代。

2平臺發展前景!

ONT平臺在軟、硬件及建庫技術等各方面不斷升級優化,如推出的R10測序芯片,將單堿基電流信號判讀率提升到2次,數據質量方面將會有了明顯改善,由于小編未有足夠的實測數據,目前就不做分享了。

目前PacBio推出Sequel II測序平臺,其單張芯片測序通量較Sequel平臺提升了8倍左右。

建庫方式

ONT平臺:在DNA測序方面,利用片段篩選,非片段篩選和片段打斷3種方式對DNA樣品進行1D建庫。

片篩即利用Bluepippin對DNA樣品進行片段篩選,并依據科研人員的實際研究需求梯度富集回收大片段用于建庫測序。非片段篩選即DNA提取后,未經過片段篩選的過程,直接進行建庫測序。片段打斷即利用g-TUBE將DNA片段打斷成20kb或其它大小的片段,這種技術在一定程度上可提升單cell產量,其可應用于個體重測序、甲基化等研究。倘若您想組裝基因組,小編還是建議使用片段篩選的方式,富集大片段進行建庫測序,經過片段篩選后,會有更大比例的長片段DNA分子穿過納米孔,這樣得到的測序讀長數據相較于其它建庫方式會普遍變長。

PB平臺:在DNA測序方面,PB一般使用g-TUBE將DNA片段打斷成20kb或30kb的文庫,對打斷的DNA樣品進行末端修復,連接啞鈴型的接頭,使用Bluepippin進行片段篩選,獲得測序文庫。

以ONT的片篩文庫和PB的文庫比較,由于PB經過了片段打斷,且受DNA聚合酶活性的影響,在讀長方面稍遜色于ONT平臺。以下就對它倆的測序數據做一比較。

測序數據

數據讀長比較,后3列依次是Read_N50,平均長度和最長reads大小,單位都是bp哦。。。。

以某物種為例,我們看看各片段的分布:

總結:從這份數據可以看出,PB 平臺18K以上的數據占39.6%,Nanopore平臺20K以上的數據可達68%。

數據糾錯

ONT平臺和PB平臺下機數據的準確率一般85%左右,后期Canu軟件進行Reads糾錯,應用Reads間去比對最長的Reads(一般后期應用30-50×的數據用于基因組組裝),數據的準確率有了大幅度提升。ONT平臺應用smart、Canu、wtbdg等 3款軟件進行組裝,racon兩輪糾錯(三代數據),pilon三輪糾錯(2代數據)后,可將基因組的準確率提升至99.99%。PB平臺一般應用smart、Canu、wtbdg、Falcon 4款軟件進行組裝,arrow糾錯(三代數據),pilon三輪糾錯(2代數據)后,可將基因組的準確率提升至99.999%。

總述

PB、ONT各有千秋,各具特色。目前百邁客已完成三代測序平臺的完整搭建,并集提取、建庫、測序于一體,可滿足科研工作者的不同測序需求;

 

 

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