R10全球首發| Nanopore全球首批R10芯片到達百邁客實驗室!

2019年7月22日,Nanopore平臺全新測序芯片R10到達百邁客實驗室,百邁客將開啟ONT平臺測序新征程!

近年來,由于三代測序相較于二代測序,擁有單分子無需擴增,長度長等絕對優勢,因此在各組學研究中大放異彩。而作為三代測序的代表技術之一,Nanopore平臺因能獲得更長讀長,在基因組學研究中更是備受青睞。但相較于二代平臺,三代平臺測序數據的準確性一直是比較大的劣勢。本次Oxford Nanopore Technologies公司即將推出的R10芯片,則劍指準確性。相較于當前廣泛使用的R9.4.1芯片,新型R10芯片可提供相當的讀長,產量及更準確的數據。

R10芯片測序原理

新升級R10芯片最大的更新是納米孔采用了雙讀取器(Reader)的設計,能夠對同一堿基進行兩次信號識別。理論上,同一堿基的識別次數為R9.4.1版本芯片2倍,由此來增加堿基的判斷率,減小隨機錯誤,并提高一致準確性。R10與R9.4.1測序方式比較如圖1

圖1??測芯片更新前后測序方式比較
R10數據準確性到底如何呢,目前的信息具體如下:

01、單reads測序準確性:

目前主流的R9.4.1芯片的表現能力如何?我們隨機抽取了200個已經完成常規ONT DNA測序的樣品(包含各種動植物)進行統計,總共約22.4T數據(足夠有代表性了),結果如下:

可以看到,R9.4.1芯片數據的讀長是非常理想的:Reads N50最高達到72 Kb,平均達到35 Kb;最長單分子讀長達到了1.6 Mb;而關于質量值平均為8.3,對應準確性為:85.21%;最高單個樣品平均質量值達到9.7,對應準確性為:89.28%;

R10的質量表現如何呢?我們統計了拿到的四個樣品的數據,具體統計結果見下圖:

圖2 R10數據質量值分布

絕大部分R10 reads的質量值達到了10以上(對應準確性為90.0%),而平均質量值為12.1(對應準確性為93.8%),而最高reads質量值已經達到了15以上(對應準確性為96.84%)。由此可見,對于單條reads來說,提升還是非常明顯的,平均reads準確性從85%提升到了93.8%。

02、Consensus序列準確:

看完單條reads準確性后,那么組裝時用到的高深度consensus序列準確性怎么樣呢?官方比較了同一樣本不同芯片測結果的準確性,見圖3。從結果可知,相同測序深度的情況下,consensus后序列的準確性Q值,R10比R9.4.1提升了5~10之間,對應的準確性最高提升了1個百分點。

圖3?不同物種中R10和R9.4.1 reads準確度

從官方的數據顯示,當數據深度為50X時,R10測序數據的consensus序列的準確性已經達到了Q44,即99.996%以上(圖4)。且隨著測序深度的增加,R10芯片一致準確性逐漸增加。官方對多物種測試發現,在100X的測序深度下,consensus準確性可以保持在Q45以上,在有些樣本上甚至已達到Q50(99.999%)水平(圖4),當然加大測序深度也可以想要達到更高水平,測試結果中,最高已經達到了Q52(99.9994%)。需要注意的是,這都是未經過二代測序數據矯正的結果!

圖4 ?不同測序深度下R10 consensus序列準確性比較
03、同聚物識別準確性:

同聚物的識別準確性是大家一直都比較關心的問題,從ONT官方釋放的測試結果顯示,相比于R9.4.1,R10版本芯片能夠顯著提高其在同聚物區域的堿基識別準確度,并且幾乎不會引入缺失錯誤(圖5)。

圖5 R10、R9.4.1芯片在同聚物區域的測序準確度
04、數據錯誤分布:

官方通過檢測同一樣本R10和R9.4.1中的錯誤在基因組上的情況,發現R9.4.1與R10的錯誤在基因組上分布并不是完全重疊的,通過兩種版本芯片的數據進行混合分析,可極大地提高序列的準確性(圖6)。這表明了,在不使用二代數據的前提下,后續也可考慮通過R10和R9.4.1數據組合的方式來提高結果的準確度!

圖6?R10和R9.4.1錯誤分布情況

小結

全新R10芯片在設計上采用了信號雙識別的策略,與R9.4.1芯片相比,有效提升原始序列,同聚物區域及Consensus序列準確性。在不使用二代數據的情況下,結合R9.4.1及R10的數據,可獲得更高的準確性!目前R10芯片全球還處于小試研發階段,如果一切順利,三季度即可大規模商用,敬請期待!

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